?本期AVT小編給大家詳細(xì)介紹一下陽離子脂質(zhì)體制備過程中常用的5款脂質(zhì)，你知道這幾款熱門脂質(zhì)具體有哪些嗎？它們又有著怎樣的應(yīng)用呢？快來了解下！

?就今年的盛夏時節(jié)，AVT可謂是火力全開，不僅帶來了高品質(zhì)高性價比的注射級蔗糖產(chǎn)品，siRNA脂質(zhì)體產(chǎn)品Onpattro的關(guān)鍵輔料DLin-MC3-DMA，還有DMG-PEG2000，DOTMA正式在艾偉拓上線！

?陽離子脂質(zhì)DLin-MC3-DMA

?DLin-MC3-DMA作為新型陽離子脂質(zhì)—可電離化陽離子脂質(zhì)的代表，具有“低毒高xiao”的優(yōu)勢，它的化學(xué)名為4-(N,N-二甲基氨基)丁酸 (6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂，分子式C₄₃H₇₉NO₂，是一種無色至淡黃色的油狀液體，pKa=6.44。

▲DLin-MC3-DMA

?DLin-MC3-DMA具有獨特的pH依賴性電荷可變特性：酸性條件下呈正電性，而生理pH條件下呈電中性。因此，核酸在酸性條件下被包裹，形成的脂質(zhì)體在血液中則具有很小的正電荷密度，即很低的細(xì)胞毒性。并且DLin-MC3-DMA陽離子脂質(zhì)體因具有正電性可增加粒子在體內(nèi)的溶酶體逃逸，提高轉(zhuǎn)染效率，而又不易被巨噬細(xì)胞吞噬。利用這些特性，DLin-MC3-DMA制備的陽離子脂質(zhì)體在siRNA遞送方面具有“低毒高xiao”的出色表現(xiàn)。

▲DLin-MC3-DMA結(jié)構(gòu)式

?DLin-MC3-DMA的產(chǎn)品信息是什么？

?中文名稱：DLin-MC3-DMA

?商品名：DLin-MC3-DMA

?化學(xué)名稱：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亞油基）甲酯

?分子式：C₄₃H₇₉NO₂

?生產(chǎn)商:艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?CAS號：1224606-06-7

?用途：陽離子脂質(zhì)體

?性狀：無色至淡黃色油狀液體

?純度：98%

?溶解性：不溶于水，易溶于DMSO、甲醇、乙醇。

?分子量：642.09

?保存條件：-20℃

?注意事項：避免與強酸、強堿、強氧化性物質(zhì)接觸

▲Onpattro

?2018年全球首ge用于治療治療家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變的siRNA脂質(zhì)體產(chǎn)品Onpattro在美上市，成功打開了沉默細(xì)胞基因藥物的大門。

?Onpattro中運用的陽離子脂質(zhì)材料DLin-MC3-DMA也開始備受關(guān)注。在這之前，DLin-MC3-DMA在國內(nèi)市場仍是一片空白。AVT基于深耕磷脂、脂質(zhì)體、脂肪乳方向多年的資源和經(jīng)驗，推出新產(chǎn)品DLin-MC3-DMA。為陽離子脂質(zhì)材料提供了一種“低毒高xiao”選擇。

?陽離子脂質(zhì)體，顧名思義，是粒子呈正電性的脂質(zhì)體制劑，所以提供正電性的陽離子脂質(zhì)是制劑關(guān)鍵。目前市場上最為常見且使用較多的陽離子類脂有DOTAP、DOTMA、DC-CHOL等，但它們在應(yīng)用中都有著較大的細(xì)胞毒性，因此載藥量和安全性兩方面常難平衡。

陽離子脂質(zhì)DMG-PEG2000

?說起DMG-PEG2000這款陽離子脂質(zhì)材料在RNA藥物脂質(zhì)體中的應(yīng)用情況，以DMG-PEG2000為代表的新型PEG化脂質(zhì)的應(yīng)用優(yōu)勢在哪里呢？AVT推出了自己的新產(chǎn)品DMG-PEG2000，這款隨著新冠肺炎mRNA疫苗的火熱研制而被大家認(rèn)識的脂質(zhì)新材料迅速躥紅，許多小伙伴只知道它和DSPE-mPEG2000一樣具有長循環(huán)作用且基因轉(zhuǎn)染效果更好，卻并不了解背后的具體原理。

?DMG-PEG2000英文全名1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000，中文名可對應(yīng)翻譯為二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000。它的分子式為C₁₂₂H₂₄₂O₅₀，分子量2509.2（平均值），代表結(jié)構(gòu)如下：

?從結(jié)構(gòu)式上就能看出，該材料是通過PEG化修飾了一種短鏈脂質(zhì)，C14比常見的DSPE-mPEG2000的C18鏈短得多，這樣最直接的結(jié)果就是脂質(zhì)“錨”嵌插入脂質(zhì)膜較“淺”，在體循環(huán)過程中較易脫落。而這一設(shè)計zui大的優(yōu)勢是解決了“PEG-dilemma”。PEG-dilemma主要有三點：

?1、PEG鏈的空間位阻作用屏蔽脂質(zhì)體與細(xì)胞膜間的相互作用，抑制靶細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝??；

?2、屏蔽脂質(zhì)體與內(nèi)涵體膜間的相互作用，妨礙“內(nèi)涵體逃逸”，導(dǎo)致RNA被降解無法順利進入細(xì)胞質(zhì)；

?3、多次注射PEG化脂質(zhì)體誘發(fā)免疫反應(yīng)，引起加速血液清除（ABC）現(xiàn)象。

?一般的解決辦法有：降低脂質(zhì)體表面PEG的密度；使用可斷裂的PEG-脂質(zhì)間linker，如酯鍵、腙鍵、肽鍵；使用短鏈脂質(zhì)，如采用C14脂質(zhì)錨定較C18更易于PEG從粒子表面解離。另外，DMG-PEG2000的短鏈（肉豆蔻酸，C14）比長鏈（硬脂酸，C18）半衰期小可更快降解，DMG-PEG2000可降低脂質(zhì)體與細(xì)胞間的相互作用及吸附ApoE的能力，獲得zui好的細(xì)胞基因沉默效果。

?“溶酶體/內(nèi)涵體逃逸”是RNA類藥物遞送的關(guān)鍵也是難點，藥效高低與其直接相關(guān)。使用含有短烷基鏈的聚乙二醇脂質(zhì)，可在實現(xiàn)體內(nèi)逃逸的同時快速解離，以此對抗PEG化造成的“內(nèi)涵體逃逸”失敗現(xiàn)象。這也是為何DSPE-mPEG2000在化藥脂質(zhì)體中常用而核酸類脂質(zhì)體藥物使用DMG-PEG2000的基因沉默/表達(dá)水平更高、藥效zui好。

?DMG-PEG2000的產(chǎn)品信息是什么？

?中文名稱：DMG-PEG2000

?商品名：DMG-PEG2000

?化學(xué)名稱：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000

?分子式：C₃₂H₆₂O₅(C₂H₄O)n, n≈45

?生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?CAS號：160743-62-4

?用途：陽離子脂質(zhì)體

?性狀：白色粉末

?溶解性：易溶于甲醇、氯仿，部分溶于水。

?分子量：約2509.2

?保存條件：-20℃

?注意事項：避免與強酸、強堿、強氧化性物質(zhì)接觸

?DMG-PEG2000的圖譜信息是這樣的：

?▼ H NMR

?▼ C NMR

陽離子脂質(zhì)DOTMA

?近年來基因療法、抗體療法、免疫療法等概念鋪天蓋地，隨之大熱的基因遞送成為研究焦點。專注輔料開發(fā)的小編本以為這是一個新興領(lǐng)域，沒想到簡單調(diào)研后卻發(fā)現(xiàn)早在三十多年前科研工作者就已經(jīng)成功利用陽離子脂質(zhì)輔DMG-PEG2000的產(chǎn)品信息是什么？料制備脂質(zhì)體用于基因轉(zhuǎn)染了。接下來要介紹的DOTMA就有著這樣的背景。

?DOTMA誕生于1987年，由Felgner等人合成出來并應(yīng)用于DNA的遞送。研究發(fā)現(xiàn)，DOTMA制備的單室脂質(zhì)體可高xiao包載DNA和RNA片段，包封率達(dá)百分之百，并且能夠很好的被細(xì)胞攝取進而表達(dá)目標(biāo)基因，細(xì)胞水平上的轉(zhuǎn)染效率較DOTAP高10倍。處方也更簡單，不需要添加DOPE等helper lipid。然而DOTMA早先并沒有被國內(nèi)陽離子脂質(zhì)體研究者所熟知，反而DOTAP、DC-CHOL等應(yīng)用更多。

?DOTMA中文名二油酰丙基氯化三甲銨，構(gòu)效關(guān)系上兩條脂肪酸短鏈（C14）組成的脂質(zhì)體較長鏈（C16或C18）有著更好的轉(zhuǎn)染效果，結(jié)構(gòu)式如下：

?容易與它混淆的DODMA是1，2-二油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷，兩者銨離子價位不同，帶電荷密度不同，自然在用法和效果方面也不一樣。

?RNA類藥物的效果與選用的陽離子脂質(zhì)材料密切相關(guān)，實驗中遇到問題的時候不妨多試幾種陽離子脂質(zhì)材料呀。

?DOTMA的基本信息是什么？

?通用名稱：DOTMA

?商品名：DOTMA

?中文名稱：二油酰丙基氯化三甲銨

?化學(xué)名稱：1,2-雙十八烯氧基-3-甲基銨丙烷 （氯鹽）

?CAS號：104872-42-6

?生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?分子式：C₄₂H₈₄ClNO₂

?用途：陽離子脂質(zhì)體

?吸濕性：無

?性狀：白色固體

?純度：96%以上

?分子量：670.575

?熔點：35~38℃

?光敏性：有

?保存條件：-20℃

?DOTMA在RNA脂質(zhì)體中發(fā)揮了怎樣的作用？

?DOTMA作為一種性能優(yōu)xiu的陽離子脂質(zhì)材料被廣應(yīng)用于非病毒基因轉(zhuǎn)染，如Invitrogen的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin。相較于DOTAP、DC-CHOL、DODMA等，它在擁有更高轉(zhuǎn)染效率的同時細(xì)胞毒性也更小，因此在藥用陽離子脂質(zhì)體開發(fā)中的研究也越來越多。

?DOTMA分子結(jié)構(gòu)上具有“較大尾扇，較小頭部”的特性，在脂質(zhì)體微觀形態(tài)、體內(nèi)穩(wěn)定性以及與細(xì)胞膜相作用等方面較DC-CHOL、DOEPC等更好。DOTAP也具有類似的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，但DOTAP對DNA/RNA的包載效率不如DOTMA，在同等藥效下DOTAP劑量要比DOTMA高得多，隨之而來的細(xì)胞毒性也就更大，安全性不如DOTMA。RNA脂質(zhì)體的效果與其所用陽離子脂質(zhì)的飽和度（雙鍵數(shù)量）、側(cè)鏈長度、頭部基團、N價態(tài)等因素密切相關(guān)，DOTMA正是綜合了這幾方面的優(yōu)勢，因此具有很好的應(yīng)用特性。一般處方設(shè)計時與膽固醇、PC類磷脂和PEG化脂質(zhì)合用。

?DOTMA的其它應(yīng)用優(yōu)缺點整理如下：

?優(yōu)點：

??對核酸包載效率高，RNA/DOTMA脂質(zhì)復(fù)合物中RNA包封率可達(dá)百分之百；

??基因轉(zhuǎn)染效率高，某些細(xì)胞上能高出DOTAP處方10倍多；

??細(xì)胞毒性較小，安全性好；

??可GMP大規(guī)模生產(chǎn)。

?缺點：

??價格較高；

??轉(zhuǎn)染效率不如DLin-MC3-DMA等可電離陽離子脂質(zhì)；

??目前仍處于實驗室研究階段，沒有上臨床的產(chǎn)品。

?圖表引用自：

?R Kola?inac, C Kleusch. Deciphering the Functional Composition of Fusogenic Liposomes. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(2), 346.

陽離子脂質(zhì)DOTAP

?根據(jù)包載的API不同，可將陽離子脂質(zhì)體分為兩大類，一類是包載以mRNA、siRNA為代表的核酸類藥物的脂質(zhì)體，是基因治療中研究最多、應(yīng)用最廣的一種非病毒載體；另一類是包載如紫杉醇、喜樹堿等小分子抗癌藥的脂質(zhì)體制劑，具有腫瘤新生血管靶向性，對癌癥也有雙重機制作用下的好療效。DOTAP是在陽離子脂質(zhì)體制備中使用最多的藥用輔料。

?常見的DOTAP（Cl），化學(xué)名為(1,2-二油氧基丙基)三甲基氯化銨，分子式C₄₂H₈₀NO₄Cl，分子量698.6，是一種季銨鹽，是帶正電荷的兩親性類脂化合物。因為生產(chǎn)工藝的不同，有些性狀呈淡黃色蠟狀，而工藝好的公司生產(chǎn)的DOTAP則是白色粉末，更便于稱量等實際操作。它是兩親分子，結(jié)構(gòu)主要由極性頭部(親水基團)、連接基團、疏水尾部三部分組成。極性頭部通常由叔胺或季銨鹽構(gòu)成，后來又研究出咪唑頭部、氨基酸頭部等。其極性頭部情況對核酸分子的包載效率以及細(xì)胞毒性均有重要的影響。因含雙鍵和正電荷，DOTAP光敏易氧化易吸濕，氧化后會發(fā)黃、變黏，因此實驗時操作需快。

?DOTAP最早應(yīng)用的商業(yè)化產(chǎn)品是轉(zhuǎn)染試劑。DOTAP的極性頭部通過靜電作用與帶有負(fù)電荷的DNA分子穩(wěn)定結(jié)合，兩者混合后可自發(fā)形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這種轉(zhuǎn)染方法非常溫和，可避免脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或者其它方式轉(zhuǎn)染帶來的細(xì)胞毒性作用，并且轉(zhuǎn)染效率高于其它的脂質(zhì)試劑。

?DOTAP的產(chǎn)品信息是什么？

?中文名稱：DOTAP

?商品名：DOTAP

?化學(xué)名稱：（2,3-二油?；?丙基）-三甲基銨-氯鹽；(2,3-二油?；?丙基)-三甲基氯化銨

?分子式：C₄₂H₈₀NO₄Cl ? ?

?生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?CAS號：132172-61-3

?級別：藥用試劑級別

?用途：陽離子脂質(zhì)體

?性狀：白色固體

?純度：99%

?分子量：698.56

?熔點：35~38℃

?保存條件：-20±5℃，遮光密閉

?注意事項：避免與強酸、強堿、強氧化性物質(zhì)接觸

?對于核酸藥物脂質(zhì)體而言，處方中DOTAP用量越大載藥量及轉(zhuǎn)染效率自然越高，但隨之而來細(xì)胞毒性也越大，制劑安全性受影響，因此兩者需平衡。學(xué)術(shù)部的同事曾做過小鼠實驗研究即毒性：當(dāng)zeta電位高于+50mV時即有可能出現(xiàn)注射立即死亡現(xiàn)象。對于包載化療藥物而言，載藥并不依賴DOTAP，處方中可添加其它中性磷脂如DSPC、DPPC等，使用劑量方面受限較小。

?應(yīng)用方面，DOTAP價格相對其它種類陽離子脂質(zhì)而言較低，性價比高，是應(yīng)用最多的陽離子脂質(zhì)，已在人體上使用——正在進行III期臨床試驗EndoTAG-1。

?EndoTAG-1是將紫杉醇包埋于帶正電荷的脂質(zhì)體中所得的陽離子脂質(zhì)體。處方如下：

?與正常脈管系統(tǒng)不同，腫瘤內(nèi)皮由于缺乏糖蛋白涂層，進而會形成具有較大負(fù)電荷的細(xì)胞表面。EndoTag-1可選擇性吸附于帶負(fù)電荷的新生腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上，即只破壞腫瘤新生血管，不攻擊健康血管。而血管內(nèi)皮細(xì)胞是腫瘤生長必不可少的，因此EndoTAG-1除了API紫杉醇發(fā)揮抗癌作用外還因DOTAP提供的正電荷抑制腫瘤新生血管生成，雙重機制作用，可有效抑制腫瘤生長。其目前處于全球性的胰腺癌及三陰性乳腺癌III期臨床階段，由臺灣杏國藥業(yè)主導(dǎo)，計劃選擇10個國jia/地區(qū)進行，現(xiàn)已成功開展：美國、臺灣地區(qū)、法國、匈牙利、南韓、俄羅斯、以色列等七個國jia及地區(qū)的III期臨床試驗。在國內(nèi)，石藥的2類藥“注射用紫杉醇陽離子脂質(zhì)體”項目也使用的是DOTAP，于2019年獲CFDA批準(zhǔn)進行乳腺癌的I期臨床。

?借鑒EndoTag-1我們可建立基于DOTAP陽離子脂質(zhì)體的技術(shù)平臺，包裹各類小分子化療藥物。如喜樹堿藥物陽離子脂質(zhì)體EndoTag-2，是基于拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑原理的新型腫瘤新生血管靶向劑。DOTAP在小分子化療藥物的陽離子脂質(zhì)體開發(fā)上潛力巨大。

陽離子脂質(zhì)DC-CHOL

?相信對于關(guān)注陽離子脂質(zhì)體的小伙伴來說DC膽固醇較為熟悉，國內(nèi)外文獻里都有其大量的應(yīng)用性質(zhì)研究及實驗數(shù)據(jù)的報導(dǎo)。作為制備陽離子脂質(zhì)體常用的正電荷脂質(zhì)，小編整理了一些DC-CHOL具有通用性的小知識來和大家做個分享。

?DC-Chol，化學(xué)名3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇，分子式C₃₂H₅₇N₂O₂Cl，是一種膽固醇衍生物，無光敏性，引濕性，不易氧化，性質(zhì)較DOTAP更穩(wěn)定。是制備陽離子脂質(zhì)體常用的正電荷脂質(zhì)之一，穩(wěn)定脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的同時為粒子提供正電性，且細(xì)胞毒性較DOTAP小。

?DC-Chol產(chǎn)品信息是什么？

?中文名稱：DC膽固醇（供注射用）

?商品名：DC-CHO

?化學(xué)名稱：3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)氨基甲?；鵠膽固醇鹽酸鹽

?分子式：C₃₂H₅₇ClN₂O₂

?生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?CAS號：166023-21-8

?級別：試劑級

?用途：脂質(zhì)體

?性狀：白色粉末

?純度：98%

?溶解性：可溶于水（部分混溶），易溶于甲醇、乙醇、氯仿、DMSO

?分子量：537.26

?保存條件：-20℃

?注意事項：避免與強酸、強堿、強氧化性物質(zhì)接觸

?在陽離子脂質(zhì)體的制備中，DC-Chol與合成磷脂DOPE是好搭檔，一般常用比例1:1或3:1，此外，處方中也常加入PEG化磷脂配合使用。大量文獻報道，DC-Chol/DOPE是低毒高xiao的核酸轉(zhuǎn)染組合，在表達(dá)目標(biāo)基因、提高治療性疫苗細(xì)胞免疫方面十分有效。

?除了應(yīng)用于治療疾病的藥物外，DC-Chol在陽離子脂質(zhì)體微泡超聲造影劑/超聲探針領(lǐng)域也有大量研究和較為普遍的應(yīng)用。目前應(yīng)用的微泡通常少量攜帶電荷或不帶電荷,基因攜帶量難以滿足治療需要。使用DC-Chol制備的新型陽離子超聲造影劑可高xiao包載基因并明顯提高體內(nèi)顯影能力。

助磷脂DOPE為什么經(jīng)常出現(xiàn)在脂質(zhì)體處方中？

?在脂質(zhì)體制劑的制備過程中，你可能在處方中經(jīng)?？吹蕉王Ａ字Ｒ掖及?strong>DOPE的身影，一般來說，正常的陽離子脂質(zhì)體處方中需含有陽離子脂質(zhì)、膽固醇、中性助磷脂以及PEG化磷脂，各種脂質(zhì)成分的選擇經(jīng)常是因項目不同而各異，但在查閱文獻過程中大家都會發(fā)現(xiàn)一個共同點，那就是處方中常出現(xiàn)DOPE的身影，這是為什么呢？

?DOPE可說是非常常用的助磷脂（helper lipid），在制備陽離子脂質(zhì)體過程中具有很強的協(xié)同作用，主要原理如下：

?1、中性不穩(wěn)定助類脂：起穩(wěn)定雙層膜和降低陽性成分毒性的作用。

?2、干擾類脂膜，使內(nèi)涵體膜不穩(wěn)定：在細(xì)胞內(nèi)能促進DNA、RNA的釋放，同時輔助陽離子脂質(zhì)體的細(xì)胞滲透。

?3、能夠確定核酸+脂質(zhì)體復(fù)合物的形態(tài)，可是脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)從多相Lα相躍遷到六角HII相，使復(fù)合物具有良好的可融性，能顯zhu提高跨膜效率。

?因此，DOPE的加入可使得陽離子脂質(zhì)體膜融合更好、穩(wěn)定性更高、細(xì)胞毒性更小。大量研究表明類脂聚合物單獨作用時不能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而加入DOPE能解決這個問題，比如使用DC-Chol/DOPE可表達(dá)CAT基因，而復(fù)合物DC-Chol/DOPC則沒有活性。

?DOPE這款磷脂的產(chǎn)品信息是什么？

?中文名稱：二油酰磷脂酰乙醇胺

?商品名：DOPE

?化學(xué)名稱：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺

?英文化學(xué)名稱：1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine

?分子式：C₄₁H₇₈NO₈P

?生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?CAS號：4004-5-1

?DMF號：28884

?EINECS：200-663-8

?級別：藥用試劑級別

?執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

?用途：脂質(zhì)體

?溶解性：不溶于水，可溶于氯仿、甲醇、乙醇

?分子量：744.03

?保存條件：-20℃

?注意事項：避免與強酸、強堿、強氧化性物質(zhì)接觸

?本期對陽離子脂質(zhì)體制備中這5款常用的陽離子脂質(zhì)的介紹先到這里，從2007年至今，AVT專注脂質(zhì)體、脂肪乳、微納米靶向制劑等遞藥體系，堅持以藥用輔料為主要業(yè)務(wù)方向，"高校+研究所+藥企"拓展模式，已覆蓋中國所有相關(guān)企業(yè)。

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